Comprendre le dépistage du SIDA
Introduction
Si vous vous êtes déjà rendu dans un laboratoire d'analyse médicale pour effectuer un dépistage, vous connaissez la musique. Un petit entretien pour évaluer une potentielle conduite à risque, une prise de sang, puis vous êtes remercié et invité à repasser dans trois jours.
Pendant cette longue attente angoissée, voilà de quoi vous occuper ! Vous vous êtes sans doute déjà demandé ce qui arrivait à votre sang une fois prélevé : découvrez comment se déroulent les tests de dépistage...
Comme précisé dans les textes officiels, deux types de tests sont majoritairement pratiqués :
- pour dépister : Test Elisa
- pour confirmer, en cas d'Elisa positif : Test Western Blot
Lorsque les tests se révèlent positifs, on dit la personne « séropositive » pour le VIH.
Attention, le terme séropositif n'a pas toujours un lien avec le Sida ! Séropositif signifie qu'un test éffectué sur le sérum s'est révélé positif, quel que soit le produit recherché.
Extrait de la Circulaire DGS/DHOS/SD6A/E 2 n° 2004-371 du 2 août 2004 relative aux consultations de dépistage anonyme et gratuit(CDAG) :
Section 1
Dispositifs médicaux de diagnostic in vitrorevêtus du marquage CE
Art. 1er.
Tout laboratoire public ou privé effectuant des analyses de biologie médicale au sens de l'article L. 6211-1 du code de la santé publique, pour le dépistage des anticorps anti-VIH 1 et 2, doit analyser isolément le sérum ou le plasma de chaque individu en utilisant deux réactifs mixtes (VIH 1 et 2) différents revêtus du marquage CE, dont au moins un réactif utilisant une technique ELISA mixte.
En cas de positivité ou de discordance des résultats de ce test de dépistage, une analyse de confirmation par Western Blot ou Immuno Blot doit être réalisée à l'initiative du biologiste sur le même prélèvement.
Avant de commencer
Lors des tests, ce n'est pas sur tout le sang du patient que travaille l'analyste, mais uniquement sur son sérum. Le sérum est un liquide jaunâtre obtenu en enlevant les cellules et protéines responsables de la coagulation dans le sang (globules rouges, globules blancs, plaquettes, protéines de coagulation...). Le sérum contient surtout les éléments nutritifs du sang et les anticorps.
Anticorps et antigènes
- Les anticorps (Ac) : eux c'est les gentils, ils sont à nous. Ce sont des protéines qui combattent les corps étrangers (d'où leur nom d'anticorps, en abrégé "Ac"). Mais ils sont très spécialisés : ils ont été formés à ne reconnaitre qu'un seul ennemi ! Par exemple, il existe des anticorps qui ne savent que reconnaitre le VIH, le virus du Sida : on parle alors d'anticorps anti VIH ou, pour les intimes, Ac-anti-VIH.
- Les antigènes (Ag) : ce sont les fameux corps étrangers, qui sont potentiellement une menace pour notre organisme. Ils peuvent être des virus, des bactéries, des protéines… bref, tout ce qui n'appartient pas à notre corps à nous. En réalité, ils sont reconnus parce qu'ils portent à leur surface des molécules (souvent des protéines ou des sucres) qui les classent automatiquement dans la catégorie des bêtes-et-méchants-à-anéantir.
Lorsqu'un Ac se fixe sur des Ag il se forme un complexe Ac/Ag.
Et maintenant, pour comprendre les tests qui seront décris plus bas, on va corser un peu.
Prenez un anticorps d'humain, et injectez le dans une chèvre (ou un cochon, dromadaire, hamster, bref, dans un animal).
Notre brave anticorps, qui avait le rôle du gentil dans son organisme humain, devient un danger pour la chèvre ! C'est normal, pour elle c'est un corps étranger. Elle va donc former, en réaction, des anticorps...anti-anticorps humains !
On obtient ainsi une classification des anticorps :
- les anticorps primaires (Ac I), ils reconnaissent des antigènes
- les anticorps secondaires (Ac II), qui reconnaissent d'autres anticorps
En général, les anticorps secondaires sont couplés à quelque chose qui va permettre d'identifier leur présence : une bille d'or, une molécule fluorescente... Pour les tests décrits ici, nous utiliserons des AcII couplés à une molécule qui se colore lorsque l'on ajoute un certain produit.
Cela commence à faire du monde dans notre histoire, mais c'est en réalité très pratique : cela permet d'identifier, à l'oeil nu, la présence d'anticorps secondaires. Si l'on veut affiner, on peut même faire ce que l'on appelle une spectrophotométrie, grâce un appareil qui quantifie précisément l'intensité de la coloration.
Pourquoi ne pas marquer directement les AcI ?
Il s'agit tout simplement d'une question d'économie : vous vous rapellez que les anticorps sont tous différents, car ils sont spécialisés pour ne reconnaitre qu'un seul antigène. Or, fabriquer des anticorps marqués est assez complexe et donc cher. Vous imaginez donc la difficulté et le prix pour marquer chaque type d'anticorps ! En utilisant des Anticorps secondaires on se simplifie la vie : "il suffit" d'achèter un lot d'Anticorps marqués, pourquoi pas de chèvre pour reprendre notre exemple, qui vont systématiquement réagir contre tout anticorps humains. En bref, il suffit d'utiliser des Ac provenant d'une espèce différente, de les marquer, et on obtient un révélateur polyvalent et pratique.
Suite du dossier
Test ELISA
- Sommaire -
Introduction
Le test ELISA est un test de laboratoire qui permet de détecter la présence de certains anticorps ou anigènes dans un produit. Grâce à la libération de couleur par les anticorps secondaires, le test ELISA permet aussi de quantifier cette présence.
Deux types de tests existent, selon la question que l'on se pose :
Le patient possède-t-il dans son sang des anticorps qui attestent de la rencontre avec le pathogène recherché ?- Elisa indirect : détection d'anticorps
Le patient ou le produit testé contient-il la substance recherchée ?- Elisa direct : détection d'antigènes
Le saviez-vous ?
Le nom ELISA provient de l'acronyme anglais : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (litérallement : test d'immunoabsorption enzymatique)
ELISA indirect
But
On recherche des anticorps particuliers ( ex : Ac anti-VIH )
Dans le cas d'un dépistage pour le SIDA, on va chercher dans le sérum du patient des anticorps dirigés contre le VIH. Pourquoi rechercher les anticorps ? Souvenez vous, les anticorps sont spécialisés à un antigène précis. Mais ils ne sont fabriqués dans le corps qu'en cas de contact avec l'antigène. En partant de ce principe, un patient qui n'a jamais été en contact avec le virus du SIDA n'aura pas d'anticorps dirigés contre lui. A l'inverse, si l'on retrouve des anticorps anti-VIH dans le sérum, c'est que le patient est infecté !
Les étapes
Les étapes de ce test sont très simples :
1- Une plaque de 96 puits est généralement utilisée, pour tester un grand nombre d'échantillons simultanément. Au fond de ces puits, des antigènes viraux sont fixés, ici des protéines de la capside du VIH.
2- Le sérum du patient est versé dans les puits. Comme pour chaque test en biologie, des échantillons témoins sont utilisés pour s'assurer de la fiabilité du matériel. Dans le cadre de ce test, il s'agira de sérums dont la composition est connue : un témoin négatif (= on sait qu'il ne contient pas d'anticorps) et un témoin positif (= on sait qu'il contient des anticorps). Le résultat obtenu doit être cohérent avec le résultat attendu, dans le cas contraire le test est invalidé.
Pour la suite du test, nous utiliserons deux exemples de patients : le patient 1 est sain [résultats 1], le patient 2 est infecté [résultats 2]. Les anticorps sont schématisés par les petites baguettes ; les antigènes par les triangles violets.
- patient 1 : il ne possède pas d'Ac anti-VIH dans son sérum. Rien ne se fixe donc sur les protéines du virus accrochées au fond. Le puit est rincé : il ne reste que les antigènes, qui sont collés et ne peuvent se détacher. Des anticorps secondaires, couplés avec une molécule (pour la coloration) sont ensuite ajoutés. Comme il n'y a pas d'anticorps primaires dans le puit, les AcII ne peuvent pas non plus se fixer et sont rincés au lavage suivant. Enfin une réaction de mise en évidence de ces derniers Ac est effectué et il ne se passe rien. Il n'y a pas de coloration : le patient est séronégatif.
- patient 2 : Des ancticorps dirigés contre le VIH sont présents dans son sérum. Ceux-ci reconnaissent les antigènes accrochés au fond du tube. Au rincage, ils y restent fixés ! Lors de l'ajout des anticorps secondaires, ceux-ci s'accrochent aux premiers anticorps et ne partent pas au lavage. Enfin, la dernière opération, qui active les molécules de couleur, révelent que des anticorps secondaires sont restés dans le puit. Il y a une coloration du tube, le patient est sérospositif.
Résumé des étapes d'un test ELISA indirect pour les cas de séronégativité (patient 1) et de séropositivité (patient 2).
En résumé...
Ce test ELISA est qualifié d'indirect puisqu'il recherche le virus de manière indirecte : le fait que le patient possède ou non des anticorps dirigés contre le virus nous indique si il a été infecté ou non !
ELISA direct
But
On recherche des antigènes (ex : protéine AgP24)
Cette variante du test ELISA appelé test ELISA direct permet de doser les antigènes présents, notamment l'Ag P24 : une protéine de la capside virale du VIH. Cette protéine est souvent recherchée dans l'hypothèse d'une primoinfection, c'est à dire durant les tout premiers stades de contamination, lorsque les anticorps sont encore trop peu nombreux pour être identifiés. En cas de comportement à risque avéré du patient, il est également possible d'effectuer une recherche d'ADN viral (en savoir plus sur la structure et le fonctionnement du VIH).
Cette méthode peut aussi être utilisée dans d'autres cas, si l'on recherche une molécule alèrgène dans un aliment par exemple.
Deux tests ELISA directs peuvent être pratiqués :
Test sandwich
Il s'agit du test inverse de l'Elisa indirect. Cette fois, c'est en fixant des anticorps dans les puits que l'on espère doser les antigènes présents dans la solution. Le test est dit en sandwich car l'antigène est pris en sandwich entre deux anticorps primaires. Puis, comme précédemment, des anticorps secondaires sont ajoutés et révèlent la présence ou l'abscence d'antigènes. Une coloration de plus en plus forte indique des concentrations d'Antigène croissantes !
Test compétition
Ce test peut paraitre un peu complexe parce qu'il nécéssite une petite gymnastique d'esprit. N'hésitez pas à relire chaque étape !
1- Des Ac primaires (et non marqués) sont incubés dans le sérum à doser. Si les antigènes ciblés par les anticorps sont présents, il y a formation de couples Ac/Ag. Plus il y a d'Antigènes, plus il y de couples formés. A l'inverse, si le sérum ne contient aucun antigène, tous les Anticorps restent libres.
2- Le tout est versé dans un puit tapissé avec les mêmes Antigènes que ceux recherchés. Dans le cas du sérum infecté, peu d'Anticorps se fixeront aux puits puisqu'ils sont déjà tous en couple ! Ils seront donc évacués au rincage, et la coloration qui suivra sera donc très faible. A l'inverse, si le sérum ne contenait pas d'antigènes, tous les Anticorps ajoutés peuvent se fixer au fond du puit et dans ce cas la coloration sera très forte.
Les résultats doivent donc être interprétés à l'inverse de l'Elisa sandwich : plus la concentration en Antigène est grande dans l'échantillon, plus la coloration est faible.
Résumé des étapes d'un test ELISA indirect compétition pour les cas de séronégativité (patient 1) et de séropositivité (patient 2).
Quelques infos supplémentaires
Nous avons ici évoqué le cas de sérums. Toutefois, en raison de leur faible coup et de leur practicité, des tests Elisa peuvent être utilisés pour de nombreux dosages, notamment la recherche d'agents allergiques dans des tests alimentaires (protéines d'oeufs, de lait, de noix, etc)
Il existe en réalité deux types de VIH: le VIH1 et le VIH2. C'est pour cette raison qu'un test de dépistage fait appel à un Elisa Mixte. Le terme mixte n'indique pas un mélange des différentes techniques du test, mais l'utilisation d'un mélange d'antigènes VIH1 et VIH2.
Le test ELISA peut être utilisé pour effectuer une analyse qualitative : la présence ou l'absence de la protéine recherchée.
Les analyses quantitatives sont des dosages : l'intensité de la coloration est analysée à l'aide de spectrophotomètres et fournit des informations sur la quantité de protéines dans l'échantillon.
En résumé...
Les test Elisa directs sont appelés ainsi parce qu'ils recherchent directement l'antigène qui nous intéressent. Les deux méthodes -sandwich ou compétition- varient dans les étapes et il faut faire attention pour intérpréter la coloration : dans un cas (sandwich), plus la couleur est intense, plus il y a d'antigènes. A l'inverse, dans le test Compétition, plus il y a de couleur et moins il y a d'antigènes. Cela demande un peu de réflexion... mais, quand on a compris les tests, c'est finallement une question de logique !
Test de confirmation : Western Blot
- Sommaire -
Lors d'un dépistage du VIH, si le test ELISA est négatif, un second test est réalisé par sécurité. Si au moins un de ces deux tests ELISA est positif, un test Western Blot (WB) est alors effectué. En effet, le test ELISA effectue une recherche générique de présence du virus, ce qui peut entraîner des faux-positifs. Le test Western Blot, plus cher et compliqué est donc utilisé pour confirmer la validité de ces tests positifs en vérifiant la présence d'anticorps anti-VIH (recherche d'anticorps spécifiques à certaines protéines virales).
Le saviez-vous ?
Son nom vient d'un jeu de mot, issu d'un autre test ( le Southern Blot, du nom de son inventeur Edwin Southern, qui concerne l'ADN). En anglais, blot signifie tache ; en effet cette technique utilise une migration de protéines sur une membrane, puis une révélation dont les résultats ressemblent à une empreinte sur buvard.
En résumé...
Le test ELISA est utilisé pour le dépistage. Le test WB - plus long et spécifique - n'est utilisé qu'en confirmation du premier dans les cas positifs.
Déroulement du test
Le test de confirmation Western Blot se déroule en trois temps:
- Séparation des protéines virales
- Recherche des anticorps spécifiques
- Diagnostic sur la séropostivité du patient
Isolement des protéines virales (Ag)
Préparation de l'échantillon
- Spécificité oblige, les agents viraux doivent être séparés. Par différentes méthodes (agent chimique, ultrasons, etc...) le virus est en quelque sorte broyé et tous ses constituants sont mélangés.
- L'échantillon est porté à ébullition : cela brise toutes les liaisons responsables de l'enroulement de la protéine. Celle ci se déroule complètement.
Sont ajoutés dans la solution :
- du TRIS: appelé tampon, il maintient un pH stable (utile quand on travaille sur des protéines).
- du DTT : composant sulfhydril, il empêche la protéine de reformer des liens (ponts disulfures).
- du SDS : il « entoure » complètement la protéine et la charge négativement tout en l'empêchant de se replier. Toutes les protéines sont donc à égalité au niveau des charges.
- du glycérol : augmente le poids. Il est plus facile de déposer le mélange dans les petits puis : celui-ci coule directement au fond.
L'intérêt de tout ces ajouts est la préparation de la séparation des protéines par électrophorèse.
L'électrophorèse
Principe : Il s'agit d'une migration des protéines sur un gel de polyacrylamide soumis à un courant électrique. Pour bien l'imaginer, il est possible d'assimiler ce gel à un réseau de pores plus ou moins serrées selon la composition du mélange choisi. L'échantillon de protéines est déposé dans des petits puits au sommet du bloc de gel. Ces petits puits sont creusés lors de la préparation du gel, ils sont distancés suffisamment pour que les échantillons ne se mélangent pas.
Désormais, la préparation détaillée plus haut prend tout son sens : le mélange a été homogénéisé au niveau des charges et de la forme des protéines et celles-ci, soumises au courant, vont migrer vers le bas du gel en fonction de leur poids moléculaire ! Plus une protéine est grande, plus elle mettra de temps à se faufiler entre les pores du gel.
Après un certain temps défini, le courant est arrêté. Les protéines ont migré et se sont réparties en bandes. A ce stade, nous possédons donc un gel avec des bandes (encore incolores !), chacune étant représentée par une certaine protéine.
Maintenant que les protéines virales sont isolées, nous allons faire entrer en jeu le sérum du patient. Mais avant il nous faut transférer les protéines virales sur un support adéquat : il n'est pas possible de manipuler sur le gel.
Transfert sur nitrocellulose
Des bandes de buvard en nitrocellulose sont utilisées. Le gel est simplement appliqué sur le gel d'électrophorèse pour récupérer les protéines.
Recherche des Anticorps spécifiques chez le patient
Le buvard est à présent incubé dans le sérum de notre patient. Si celui-ci présente des anticorps spécifiques aux diverses protéines virales, ceux-ci vont se répartir sur les bandes du buvard, selon les protéines reconnues.
Le buvard est retiré. En théorie, si le patient est infecté par le VIH, à la surface du buvard nous avons les protéines virales par dessus lesquelles se sont fixés les anticorps. Des anticorps secondaires peuvent être ajoutés. Comme auparavant pour le test ELISA, ceux-ci sont couplés à un révélateur enzymatique. Les anticorps du patient sont alors révélés !
Le test est déclaré positif si il présente des anticorps contre au moins deux des trois glycoprotéines virales (gp160, gp120 ou gp41) ou s'il présente la protéine p24 et la glycoprotéine gp160 (début d'infection)
Il ne faut pas oublier les témoins essentiels pour chaque manipulation, ce sont des références.
Un témoin positif = le sérum témoin contient tous les anticorps. Toutes les bandes virales sont révélées : cela permet de les localiser et de comparer avec celles du témoin.
Un témoin négatif = aucun anticorps n'est présent dans le sérum témoin. La révélation ne doit présenter aucune coloration pour que le test soit jugé fiable.
Evolution particulière et symptomes de la maladie
Evolution typique après infection par VIH-1 (d'après l'Université Libre de Bruxelles)
courbe verte : état du système immunitaire (évolution de du taux des lymphocytes T CD4+ de la personne infectée)
courbe rouge : progression du virus (évolution du taux de virus VIH-1 (mesure de son ARN) circulant dans le sang)
Primo-infection : le virus pénètre dans les cellules du système immunitaire.
Virémie aiguë : le virus infecte les cellules du système immunitaire et les détruit. Beaucoup de nouveaux virus sont crées et parallèlement, un nombre important de lymphocytes T CD4+ sont détruits. A ce stade une fatigue physique et des symptomes gripaux peuvent être visibles. Cependant le système immunitaire remonte la pente et arrive à maîtriser l'avancée de l'infection.
S'ensuit alors une phase de latence, pouvant durer une vingtaine d'année, qui est sans symptome. Le taux de lymphocytes se maintient ; le virus se multiplie mais reste sous contrôle du système immunitaire. Au fil du temps, le taux de lymphocytes baisse de plus en plus et le virus, entamant une multiplication rapide, finit par prendre le dessus.
Commence alors la phase SIDA proprement dite : le patient ne possède plus de système immunitaire efficace l'organisme ne parvient plus à assurer sa défense contre les maladies opportunistes. En effet, on ne meurt pas "directement" de l'infection du VIH, mais par des maladies que l'on développe suite à l'anéantissemnt de notre système immunitaire.
Pour être efficace, les dépistages ne peuvent être fait n'importe quand. Ils se font en fonction de l'état présumé d'avancement de la maladie et de la quantité d'Ag potentiellement présents :
- dès le 10ème jour: détection de l'ARN proviral (obtenu par amplification PCR)
- dès le 15ème jour : détection de l'Ag P24
- dès le 22ème jour : dépistage par test ELISA
En résumé...
- Si Elisa 1 négatif = on effectue un Elisa 2 de confirmation sur même échantillon
- Si Elisa 1 ou 2 positif = confirmation par WB sur nouveau prélèvement (au cas où la séropositivité serait due à un problème dans le premier échantillon, une contamination par exemple)
Dans certains cas le test n'est pas performant :
- Test effectué trop tôt : pas encore assez d'Ac dans le sang.
- Test effectué très tard : peu d'Ac ce qui témoigne de l'effondrement du système immunitaire.
Références
- Circulaire relative aux consultations de dépistage anonyme et gratuit(CDAG) du ministère de la santé et des sports
- méthodes physiques de séparation et d'analyse et méthodes de dosage des biomolécules (document du snv-jussieu)
- virus de l'immunodefiscience humaine (cours du CHU de besançon)
- cours de L1 et L2 en biologie